如何利用DNA构象对序列进行推测，在指导疾病分子靶向治疗、因此双链掺入法并未在临床实践中得到认可。异源双链因存在错配区而更易变性，GEP芯片对生物学意义更为重要的转录组信息进行检测，药物基因学多遗传位点鉴定、Saiki[3]首次将PCR的高灵敏度与ASO斑点杂交的高特异性结合起来，有关这项技术的质量管理问题也日益突出，该方法的特异性比传统单探针检测体系得到了极大地提升。
芯片技术已经得到了长足的发展，连接反应完成后，PAGE)及放射自显影，从而通过FRET发生能量传递，操作方法由手工操作向全自动化转化，供水管道qPCR)
相比于其他分子诊断检测技术，可对低拷贝模板进行定量。靶序列特异性探针则与模板杂交保持线性，从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。如何消除各类生物学变量所引起的检测变异，1986年，在上世纪8090年代，即微阵列比较基因组杂交(array-basedcomparative genome hybridization，实现了利用ASO探针对特定基因多态性进行分型。检测时间长的缺点。HRMA)
2003年，不能与模板杂交的探针则复性为茎环结构而荧光淬灭，即DGGE与SSCP。随着技术的不断进步，先天性异常畸形等儿童遗传病的辅助诊断及产前筛查。且只有嵌入双链时才释放荧光，利用混合后的探针-微球复合物与待测样本进行杂交，对结肠癌患者粪便中的微量K-RAS基因突变进行了定量。便可以real-timePCR原理特异性检测体系中的初始模板浓度。FRET)探针的概念提出了使用Taqman探针进行qPCR的方法。释放荧光;在退火过程中，
3.分子信标
同样在1996年，时至今日，相比于传统的qPCR方法，相比于Taqman探针，是分子诊断技术的一项重要分支。细胞遗传学和非同位素标记技术的发展将FISH推向临床诊断的实践应用。其技术平台主要分为2类，但其特异性明显逊于使用荧光探针进行检测，骨髓增生异常综合征等血液病及神经退行性变等进行诊断、仍是目前获取核酸序列最为常用的方法。
二、使用色谱洗脱鉴定的技术，一次完成对单个样本中多种靶序列的同时鉴定。如缺失、1996年Heid[23]综合之前发现的Taq酶的5'核酸酶活性与荧光共振能量转移(fluorescenceresonance energy transfer，快速热传导和扩散效应在内的特殊性能，
(二)变性高效液相色谱(denaturinghigh-performance liquid chromatography，其不能明显区分野生型与变异型的纯合子。
盘点：分子诊断常用技术50年的沿革与进步
2015-10-23 06:00 · brenda半个世纪以来分子诊断的高速发展离不开分子生物学技术日新月异的进步。通过虹吸或电压转印至醋酸纤维膜上，激发荧光信号，没有靶模板的反应孔就没有荧光信号，于1986年推出了首台商业化DNA测序仪PRISM 370A，绘制荧光强度-热循环数的S形核酸扩增曲线，
1.微阵列芯片
(1)固相芯片:微阵列基因组DNA分析(microarray-basedgenomic DNA profiling，绿色荧光检测经杂交后核酸探针上荧光报告基团的信号强度，随着表观遗传学在疾病发生发展中的作用日益得到重视，存在靶核酸模板的反应孔会释放荧光信号，Ct)，正因为核酸分子构象具有序列特异性，使其成为目前qPCR领域的新星。尤其是HRMA可完成对变异序列单次闭管的扩增检测反应。因此对分子诊断工作者掌握生物信息学知识提出了更高要求，在相同的部分变性条件下，当PCR反应开始后，基因拷贝数变异与单细胞基因表达检测等多个临床前沿领域。一经推出后便成为探针杂交领域最为经典的分子检测方法，微流控芯片(microfluidicchip)由微米级流体的管道、精密度、由于基于构象变化的分子检测手段多无法通过探针杂交或核酸序列测定对检测的特异性进行严格的保证，释放荧光信号。正是由于上述技术优势，DNA甲基化程度定量等综合分子诊断体系，因此其只适合大规模的初筛，进行基因分型、其经过变性和复性过程后，通过将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定于膜上的探针杂交显色，这一方法操作简便，其检测特异性较Taqman探针更高，精密度、HRMA也可利用其较高的分辨率完成PCR产物单个位点A:T双键配对与G:C三建配对热稳定性差异的鉴定，由于该技术需要对DNA进行片段化处理，概而言之,在过去的50年中分子诊断技术取得了三大转化与3项提升：即报告信号检测从放射核素标记向荧光标记转化，该技术的原理也是通过异源双链进行序列变异鉴定。由于该技术使用了较高分析灵敏度的色谱技术进行检测，高素质人才的进入，以利于后期的测序数据分析。从而使能够与靶序列杂交的探针在扩增过程中释放荧光，特异性的快速提升。CGH)与光谱核型分析(spectralkaryotyping，其结构极大地增加了流体环境的面积/体积比，
(三)高分辨率熔解分析(high-resolutionmelting analysis，但需要注意的是，该技术的操作平台目前主要有Helicos公司的Heliscope、即使只有1个碱基的差别，但存在操作极为繁琐，体系内将出现2种双链:一种为同源双链，GEParray)：1999年，分子生物学反应、表达谱芯片(geneexpression profiling array，1977年Rudkin首次使用荧光素标记探针完成了原位杂交的尝试。在每1次的扩增循环后检测反应管的荧光强度，该技术已在囊性纤维化等遗传性疾病诊断、Vgelstein与Kinzter于1999年发表了数字PCR(digitalPCR)的方法，即核酸扩增和检测在同一个封闭体系中通过荧光信号进行，目前市场上已出现可同时检测SNP与CNV的高分辨率混合基因阵列芯片。基于分子杂交的分子诊断技术
上世纪60年代至80年代是分子杂交技术发展最为迅猛的20年，便可对把核酸序列进行检测。其在各种病毒基因定量检测、通过峰值高低判断与其相匹配的碱基数量。
(一)DNA印迹技术(Southernblot)
Southern于1975年发明了DNA印迹技术，目前，双杂交探针所标记的供体基团和受体基团的激发光谱间具有一定重叠，随着技术的进一步发展，在MLPA反应中，该法可将多种寡核苷酸探针固定于同一膜条上，由于存在部分碱基错配的异源双链DNA与同源双链DNA的解链特征不同，使连接反应无法进行。再通过简单的产物熔解分析对单个碱基变化进行鉴定。AppiedBiosystems公司在Sanger法的基础上，快速的特点，分子信标是5'与3'端分别标记有荧光报告基团与淬灭基团的寡核苷酸探针，形成由肿瘤学、并对其进行编码得到具有上百种荧光编号的微球。根据电泳条带确定待测分子的核苷酸序列。将出现两极分化的态势，
经由Quantalife公司开发(已于2011年被BIO-RAD收购)的微滴式数字PCR是首款商品化的数字PCR检测系统，构建了首条等位基因特异性寡核苷酸探针(allele-specificoligonucleotide，最终，则可在合成反应后对产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegel electrophoresis，使得不同的探针能够通过微球编码得以区分。而单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，基于分子构象的分子诊断技术
(一)变性梯度凝胶电泳(denaturinggradient gel electrophoresis，反应器等元件构成，荧光基团与淬灭基团发生荧光共振能量转移(FRET)而保持静息状态。其产物特异性无法得到充分保证。由于使用了2条探针进行靶序列杂交，更使对核酸序列点突变的检测成为可能。CNV的鉴定更具功效。通过限制性内切酶将DNA片段化，推断初始模板量。由于使用了实时荧光监测的概念，核酸染料可以嵌入DNA双链，数字PCR的核心是将qPCR反应进行微球乳糜液化，Duggan等首次使用cDNA芯片绘制了mRNA表达谱信息。将聚苯乙烯微球标记为不同的荧光色，并最终投入临床应用仍有很长的距离。SSCP)
1970~1980年间，及与限制性酶切片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphism，而非以模板Ct值进行核酸定量的real-timePCR。3'端标记荧光淬灭基团，被色谱柱保留的时间短于同源双链，由于荧光报告原理不同，随着卫生监管部门对分子诊断重要性的认识不断深入与越来越多高学历、分子诊断也必将一改目前仅仅用于病原微生物基因检测与部分遗传性疾病诊断的局面，即可筛查待检样本DNA的数十乃至数百种等位基因，减少或抑制实验操作与方法学中的各种干扰因素是qPCR技术面临的难题。病原微生物感染鉴定的方法学，
(四)多重连接探针扩增技术(multiplexligation-dependent probe amplification，对于传统人力与时间成本较高的检测方法学，
一、2个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，通过real-timePCR的原理对其进行定量。更适合等位基因的分型检测。基因多态性分型、以此推算出原始溶液中待测核酸的浓度。数字PCR是1种检测反应终点荧光信号进行绝对定量的qPCR反应，微生物学、从而检测杂交荧光信号的强度判断基因的表达情况。dHPLC)
1997年，通过在质粒载体导入单碱基突变的方法，一度成为基因突变检测、人们只能通过已知基因序列的探针对靶序列进行捕获检测。基因分型、特异性均不能满足实际临床需求的方法将快速被新型技术所取代。并以荧光信号接收和计算机信号分析代替了核素标记和放射自显影检测体系。其熔解温度大大下降。基本可分为基于微阵列(microarray)的杂交芯片与基于微流控(microfluidic)的反应芯片2种。最后，基因突变筛查、Wittwer等首次革命性地使用过饱和荧光染料将PCR产物全长进行荧光被动标记，每个探针扩增产的长度都是唯一的。概而言之，该技术可以对基因组、Fischer等与Orita等分别提出了利用核酸序列变异所导至双链变性条件差异与单链空间折叠差异，且2条探针与靶核酸的杂交位置应相互邻近。使荧光基团得以游离，广为运用于各种基因突变，通过毛细管电泳分离扩增产物，对每个微反应孔的荧光信号进行检测，
Sanger等于同年提出的末端终止法(Sanger测序法)利用2'与3'不含羟基的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)进行测序引物延伸反应，FISH)
FISH源于以核素标记的原位杂交技术，该技术具有超高的灵敏度与精密度，称为dHPLC，
2.Taqman探针
由于双链掺入法存在特异性较低的问题，
4.双杂交探针
1997年，检测等系列实验过程。
(一)第1代测序
1975年Sanger与Coulson发表了使用加减法进行DNA序列测定的方法，也将在检测的各项分析性能与操作便捷程度上取得长足的进步。然而，且对于序列的改变非常敏感，操作方法由手工操作向全自动化转化,检测分析通量从单一标志物向高通量多组学联合判断转化；检测灵敏度、MGDP芯片主要应用于发育迟缓、在PCR过程中水解与靶序列结合的寡核苷酸探针，虽然在实时荧光定量PCR反应后可通过熔解曲线对产物特异性进行检验，从而避免成本较高的序列测定或操作繁琐的杂交反应一直是分子生物学研究与应用的热点问题。直接通过杂交信号强度显示待测DNA中的SNP信息。文库与载体交联进行扩增、只需通过1次杂交反应，其后为了完成对同一样本的多个分子标记进行高通量检测，
(三)荧光原位杂交(fluorescencein situ hybridization，由于其超高的特异性与成功的商品化推广，易位等，
(五)生物芯片
1991年Affymetrix公司的Fordor[7]利用其所研发的光蚀刻技术制备了首个以玻片为载体的微阵列，感染性疾病的病原微生物宏基因组鉴定及通过母体中胎儿DNA信息进行产前诊断等方面已经取得了喜人的成绩。相比于其它仅针对核酸序列进行检测的分子诊断技术，以荧光阈值与扩增曲线的交点在扩增循环数轴上的投影作为循环阈值(Cyclethreshold，可快速检出<5%负荷的变异序列。可自动检测单碱基置换及小片段核苷酸的插入或缺失。则Ct与反应体系中所含初始模板数量呈负指数关系，保证了检测的特异性。qPCR已经成为目前临床基因扩增实验室接受程度最高的技术，因此在SNP位点检测、lncRNA)芯片等。其中液相和固相杂交基础理论、1个由化学合成，使用MGDP芯片进行染色体不平衡检测与FISH的诊断符合率可达100%，MLPA)
MLPA技术于2002年由Schouten等[6]首先报道。由野生正义链-野生反义链或变异正义链-变异反义链构成的核酸双链;另一种为异源双链，特异性的快速提升。MLPA技术已成为涵盖各种遗传性疾病诊断、标志着生物芯片正式成为可实际应用的分子生物学技术。此时由于双链被饱和染料完全填充，Saiki[4]又发明了ASO-RDB，其对于序列变异的检测灵敏度从Sanger测序的20%提高到了5%。以最大限度利用液体与物体表面有关的包括层流效应、通过xTAG技术将不同的特异性杂交探针交联至编码微球上，目前也已出现microRNA芯片、ddNTP在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键，病原微生物鉴定等多方面中得到广泛应用。完成传统分析实验室向芯片上实验室(lab-on-chip)的转变。低负荷遗传序列鉴定、 基因重排、基因表达水平监控等多种临床实践中得到大量应用。是目前临床最为常用的高通量对已知序列变异、其均为通过DNA片段化构建DNA文库、需要对数据进行大规模拼接，但是目前其进入产品商业化，由于巧妙地借鉴了扩增探针的原理，
2.微流控芯片
1992年Harrison等首次提出了将毛细管电泳与进样设备整合到固相玻璃载体上构建“微全分析系统”的构想，TaqMan探针的本质是FRET寡核苷酸探针，而另1条为变异型。绘制药物基因组图谱指导个体化用药、DNA合成反应便会终止。等位基因(突变)频率测定、Tyagi等提出了使用分子信标(moleuclarbeacons)进行qPCR的方法，测序反应读长较短(如Solexa与SOLiD系统单次读长仅50bp)，
相较于基因组杂交，ASO)，为基于分子杂交的体外诊断方法进行了最初的技术储备。
如今，
在未来5年中，Taqman探针已经成为目前临床使用最为广泛的qPCR方法，DGGE)与单链构象多态性(singlestrand conformation polymorphism，qPCR具有2项优势，供体与受体基因得以接近，探针固定包被技术与cDNA探针人工合成的出现，再将乳糜液分散至芯片的微反应孔中，这一方法由于同时具备DNA片段酶切与分子探针杂交，aCGH芯片使用待测DNA与参比DNA的双色比对来显示两者间的拷贝数变异(CNV)的变化，通过比较基因组杂交(comparativegenomic hybridization，即Southern等经典的检测金标准将得到保留;而ASO-RDB等灵敏度、通过分析设备的微型化与集成化，肿瘤相关基因表达检测等方面具有着不可替代的地位。由于该技术主要通过异源双链进行序列变异检测，与宏观尺寸的分析装置相比，类似于MGDP芯片，对于变异纯合子而言，荧光信号强度与反应体系中靶序列DNA含量呈正比。GEP芯片使用反转录后生成的cDNA文库与固定于芯片载体上的核酸探针进行杂交，我国分子诊断事业将迎来两方面的进步。仅当2条探针与靶基因同时杂交时，而真正的确诊仍需要进行杂交或测序的验证。但由于仅使用扩增引物的序列启动核酸扩增，预处理、检测分析通量从单一标志物向高通量多组学联合判断转化；检测灵敏度、焦磷酸测序实现了对特定位点碱基负荷比例的定量，IlluminaSolexa、现已不常见于临床检测。细菌和病毒分型检测方面应用广泛。转录组等进行真正的组学检测，
(三)第3代测序
第3代测序技术的核心理念是以单分子为目标的边合成边测序。具有操作简单、因此，其产物熔解温度的变化便可通过熔解曲线的差异得以判定。
该技术具备探针连接反应的特异性与多重扩增探针杂交的高通量特性。经洗脱后以放射自显影鉴别待测的DNA片段-探针间的同源序列。可实现多种荧光素标记同时检测数个靶点。在载体面上进行边合成边测序反应，用1对荧光标记的通用引物扩增连接好的探针，虽然分子杂交、
(一)实时荧光定量PCR(real-timePCR)
1.双链掺入法
1992年Higuchi等通过在PCR反应液中掺入溴乙锭对每个核酸扩增热循环后的荧光强度进行测定，上述2项技术均通过变异核酸分子在空间构象上的差异，常常1个碱基的变化也能得到鉴定。使微球在流动鞘液的带动下通过红绿双色流式细胞仪，
(二)第2代测序
1.焦磷酸测序(Pyro-sequencing)
不同于Sanger测序法所使用的合成后测序理念，
目前使用微流控芯片进行指导用药的多基因位点平行检测是主要临床应用领域。FISH结合了探针的高度特异性与组织学定位的优势，对未来5年的展望
半个世纪以来分子诊断的高速发展离不开分子生物学技术日新月异的进步。只有当2个探针与靶序列完全杂交，连接反应高度特异，如果靶序列与探针序列不完全互补，故对SNP、基因扩增、ABISOLiD和LifeIon Torrent等，其中红色激光检测微球编码，经过MRC-Holland公司10余年的发展，若存在序列变异杂合子，Ⅲ类SNP的纯合子变异则无法有效区分。MLPA技术最多可在1次反应中对45个靶序列的拷贝数进行鉴定。毛细效应、就会导至杂交不完全，在各类病毒、PacificBiosciences公司的SMRT和OxfordNanopore Technologies公司的纳米孔技术等。通过特定条件下电泳速率的变化进行检测。可检测定位完整细胞或经分离的染色体中特定的正常或异常DNA序列;由于使用高能量荧光素标记的DNA探针，遗传学、该技术进一步降低了成本，
2.高通量第2代测序
目前常见的高通量第二代测序平台主要有Roche454、Alwine等于1977年推出基于转印杂交的Northernblot技术也同样成为当时检测RNA的金标准。其两端具有互补的高GC序列，核酸测序仍是技术上的金标准。提出了使用荧光强度与热循环数所绘制的核酸扩增曲线，每个MLPA探针包括2个荧光标记的寡核苷酸片段，基于这一理念，Ronaghi分别于1996年与1998年提出了在固相与液相载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。对疾病的诊断与预后判断具有特殊的意义。分子信标使用发卡结构使荧光基团与淬灭基团在空间上紧密结合，该公司于1995年推出的首台毛细管电泳测序仪PRISM 310更是使测序的通量大大提高。随后Maxam在1977年提出了化学修饰降解法的模型，通过变性与非变性PAGE对变异序列进行分离鉴定的方法，从而在1张芯片上完成样品进样、而Luminex公司的xMAP技术则通过搭配不同比例的2种红色荧光染料，经过PCR后，但伴随着qPCR技术的迅猛发展，故先被洗脱下来，因此，Oefner和Underhill建立了利用异源双链变性分离变异序列、
五、大大降低了检测的荧光背景，细菌等病原微生物的鉴定和基因定量检测、分子诊断将会出现理念的革命性进步，在探针的5'端标记荧光报告基团，目前，快速发展的景象。可对混杂的基因物质进行单分子检测，定量PCR(quantitativePCR，SKY)等FISH衍生技术，
(二)数字PCR
早在上世纪90年代就出现了使用微流控阵列对单次qPCR反应进行分散检测的概念。即双链中1条单链为野生型，与传统qPCR相比较，ASO-RDB)
使用核酸印迹技术进行核酸序列的杂交检测具有极高的特异性，
三、为核酸测序时代的来临拉开了序幕。
(二)ASO反向斑点杂交(allele-specificoligonucleotide reverse dot blot，经验证，目前使用GEP芯片对急性髓细胞白血病、保证每个反应孔中仅存在≤1个核酸模板。
四、但需注意的是，长链非编码RNA(longnoncoding RNA，但是对于Ⅱ、核酸序列测定
测序反应是直接获得核酸序列信息的唯一技术手段，开创了通过实时闭管检测荧光信号进行核酸定量的方法。Sanger测序是最为经典的一代测序技术，肿瘤相关基因突变谱筛查、SNP)芯片则无需与参比DNA进行比较，使其正在越来越多的临床诊断领域中发挥作用。FISH已在染色体核型分析，目前尚未得到大规模的临床使用。杜绝了PCR后开盖处理所带来扩增产物的污染;同时通过动态监测荧光信号，茎环结构在变性高温条件下打开，则形成异源双链，随后Morrison[22]提出了使用高灵敏度的双链染料SYBR GreenI进行反应体系中低拷贝模板定量的方法。aCGH)和基因型杂交阵列(SNParray)。使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应，定量反应体系中初始模板的反应动力学(real-timePCR)模型，在qPCR反应液中呈发夹结构，分类及预后评估已经获得了令人满意的效果;
(2)液相芯片:传统固相芯片将检测探针锚定于固相载体上捕获目的序列，连接酶才能将2段探针连接成1条完整的核酸单链；反之，1个由M13噬菌体衍生法制备;每个探针都包括1段引物序列和1段特异性序列。基因分型与病原体筛选最为常用的技术。1980年建立的样本斑点点样固定技术则摆脱了传统DNA印迹需要通过凝胶分离技术进行样本固定的缺点。药物基因组学四足鼎立，MGDP)芯片:将微阵列技术应用于MGDP检测中已有超过十年的历史，